Produktionsprocessen för polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) innefattar huvudsakligen steg som gelberedning, elektroforesoperation, färgning och resultatobservation.
Gelberedning Separationsgel (10 %) beredning: Blanda 0 ml ddH₂O, 3 mL 30 % stamgel, 5 mL 5 mol/L Tris- HCl, 1 mL 10 % SDS och 1 mL 10 % AP, tillsätt 10 μL av TEM och förslut sedan 10 μL av TEM, och försegla sedan TEM blanda väl. Häll denna blandning mellan glasplattorna, försegla toppen med vatten och vänta i 30~60 minuter för att gelen ska polymeriseras fullständigt.
Beredning av staplingsgel (4 %): Blanda 4 ml ddH₂O, 33 ml 30 % stamgel, 25 mL 1 mol/L Tris-HCl, 0,2 ml 10 % SDS och 0,2 ml 10 % AP, tillsätt 2 μL TEMED och blanda väl omedelbart. Häll av vattnet på separationsgelen, tillsätt denna blandning och sätt omedelbart in kammen mellan glasplattorna och vänta i 15-30 minuter på att staplingsgelen ska polymeriseras fullständigt.
Elektroforesoperation Provbehandling: Blanda provet med en lika stor mängd 2XSDS-laddningsbuffert, värm vid 100 grader i 3 -5 minuter och centrifugera sedan vid 12 000 rpm i 1 minut och ta supernatanten för SDS-PAGE-analys.
"Laddning": Ta 10 μL inducerade och oinducerade prover och lägg till dem i provpoolen och tillsätt 20 μL lågmolekylära proteinstandarder som en kontroll.
Elektrofores: Lägg till 1X elektroforesbuffert till elektroforestanken, anslut strömförsörjningen, håll spänningen för staplingsgelen vid 60V och spänningen för separationsgelen vid 100V. När bromfenolblått når botten av elektroforestanken, stoppa elektroforesen (cirka 3 timmar).
Färgning och resultatobservation
Färgning: Ta bort gelén från glasplattan och färga den med Coomassie Brilliant Blue-färgningslösning i 4 till 6 timmar vid rumstemperatur. Avfärgning: Placera den färgade gelén i avfärgningslösning och avfärga den flera gånger tills proteinbandet är tydligt synligt. Observation av resultat: Efter avfärgning kan gelén fotograferas och sparas. När avfärgningssteget är klart, placera gelén under bildbehandlingssystemet för fotografering och spara resultatet på en diskett.